Bảo quản tinh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Bảo quản tinh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) dài hạn bằng nitơ lỏng

I. Ðặt vấn đề

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thuộc họ Pangsiidae là loài cá bản địa ở hạ lưu sông Mêkông. Ðồng bằng sông Cửu Long có truyền thống nuôi cá tra ở quy mô nông hộ từ lâu đời. Trước đây nguồn giống được vớt từ sông Tiền và sông Hậu. Bắt đầu từ năm 2000, phương pháp khai thác này đã bị nghiêm cấm để bảo vệ nguồn lợi tự nhiên.

Trong quy trình sản xuất nhân tạo cá tra, một vấn đề còn tồn tại là cá đực thành thục sinh dục chậm hơn cá cái từ 2- 4 tuần. Phương pháp bảo quản tinh đông cá tra có thể giúp các trại giống mở rộng sản xuất cũng như giảm chi phí nuôi giữ số lượng cá đực.

Kỹ thuật bảo quản tinh cá tra đông còn phục vụ cho các công nghệ di truyền khác như tạo cá mẫu sinh hoặc phụ sinh. Hiện các nghiên cứu về bảo quản đông lạnh tinh cá tra trên thế giới còn rất hiếm hoi.

Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II đã tiến hành nghiên cứu “Phương pháp bảo quản tinh cá tra dài hạn bằng nitơ lỏng” trong thời gian từ tháng 5/2001- 10/2003 tại xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. Nghiên cứu này là một phần của nhiệm vụ thường xuyên “lưu giữ nguồn gen và giống thuỷ sản nước ngọt” hướng tới việc hình thành ngân hàng gen, góp phần bảo vệ đa dạng sinh học các giống loài thuỷ sản.

Cách phân biệt cá tra và cá ba sa

II. Phương pháp nghiên cứu

1. Thu hồi mẫu tinh cá

Cá tra đực được tiêm 1.000 IU HCG/kg (Human Chorionic Gonadotropin), thụ tinh sau khi tiêm 12 giờ ở nhiệt độ phòng, tinh được giữ lạnh trong các bơm tiêm ở 4oC.

2. Ðánh giá chất lượng tinh dịch cá

– Xác định độ vận động:

Ðộ vận động của tinh trùng được xem bằng kính hiểm vi quang học Meiji, độ phóng đại 400 lần trước khi làm đông. Dùng một sợi kẽm nhỏ dẹt chấm vào tinh dịch, phết lên lam kính, sau đó thêm một giọt nước hoạt hoá tinh trùng để xem độ vận động của nó. Tinh trùng có ba hình thức vận động: tiến thẳng, xoay tròn và lắc lư. Trong thí nghiệm chỉ sử dụng những mẫu tinh dịch có tỷ lệ tinh trùng vận động tiến thẳng trên 80%. Ðộ vận động của tinh trùng cũng đựơc ở từng thời điểm của quy trình làm đông như: sau thời gian cân bằng, ngay sau khi làm đông và sau các thời gian bảo quản khác nhau.

– Xác định mật độ tinh trùng:

Mật độ tinh trùng được kiểm tra bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiểm vi vì có độ phóng đại 400 lần. Tinh dịch được pha loãng 4.000 lần đề dễ dàng đếm số lượng tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu.

Công thức tính mật độ tinh trùng: D = N x R x 4.000 x 1.000 / 80

Trong đó:

D: mật độ tinh trùng (tinh trùng/ml)

N: tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm

R: hệ số pha loãng

– Ðo độ pH:

Ðộ pH của tinh dịch được đo bằng máy pH WTW (Ðức). Nhúng đầu điện cực của máy đo pH vào tinh dịch, đọc kết quả khi có dấu hiệu báo kết thúc quá trình đo.

3. Pha loãng tinh với dung dịch bảo quản và cân bằng hoá

Thí nghiệm sử dụng dung dịch bảo quản Hanks không canxi (Calcium- Free Hanks Balance Salt Solution) và dung dịch Hanks (Hanks Balance Salt Solution) (bảng1). Chất chống đông được sử dụng là 10% DMSO.

Bảng 1. Thành phần của các dung dịch bảo quản

Thành phần	Hanks (g/l)	Hanks không canxi (g/l)
NaCl	8,00	8,89
KCl	0,40	0,44
CaCl2.2H2O	0,16
MgSO4.7H2O	0,20	0,22
Na2HPO4	0,06	0,13
KH2PO4	0,06	0,07
NaHCO3	0,35	0,39
C6H12O6(Glucose)	1,00	1,11

Tinh dịch và dung dịch bảo quản được giữ lạnh ở 40C trước khi pha loãng.Tỷ lệ pha loãng của tinh dịch và dung dịch bảo quản là 1:9 trong các thí nghiệm của năm 2000- 2002 và tỷ 1:5 trong thí nghiệm của năm 2003. Thời gian cân bằng là 5 phút. Trong thời gian cân bằng, tinh dịch pha loãng được bơm vào các cọng rạ 0,25ml. Ðoạn 0,5cm cuối của ống được để trống nhằm tránh cho tinh trùng tiếp xúc với nước trong quá trình rã đông. Dùng kẹp hơ nóng để hàn dính đầu ống.

4. Làm đông và bảo quản

Tinh dịch pha loãng được bằng máy đông tinh Nicool LM10 theo quy trình làm đông như sau: Từ 40C đến – 40C tốc độ hạ nhiệt 40C/ phút, từ -40 đến -420C tốc độ hạ nhiệt 8-100C/phút. Tiếp theo, mẫu được nhúng thẳng vào nitơ lỏng (-1960C) trong 10 phút. Sau khi kết thúc quá trình làm lạnh, các mẫu tinh đông được bảo quản lâu dài trong bình nitơ lỏng GT35.

5. Rã đông

Các cọng rạ chứa tinh đông được rã đông sau thời gian bảo quản từ 7 ngày đến 3 tháng trong nitơ lỏng. Các cọng rạ được nhúng trong nước ấm 400C trong 10 giây để rã đông được kiểm tra hoạt lực và thụ tinh với trứng ngay sau khi rã đông.

6. Thu trứng, thụ tinh và ấp trứng

Cá tra cái được tiêm HCG bốn lần với liều như sau: liều I là 500 IU, liều II là 500-700 IU, liều III là 500-800 IU và liều IV là 3.000-3.500 IU kết hợp với 0,6mg não thuỳ. Mỗi lần tiêm cách nhau 24 giờ (ở nhiệt độ nước trung bình 280C). Mỗi lần thí nghiệm chỉ sử dụng trứng của một cá cái. Tinh rã đông có thể tích 0,25ml được đem gieo cho 100-300 trứng trong đĩa petri, trộn đều trong một phút, sau đó thêm nước sạch vào khuấy nhẹ và rải cho trứng bám đều trong đĩa. Các đĩa trứng được ấp trong thau nhựa đường kính 50cm (5/6 đĩa/chậu) có sục khí. Ngoài ra phương pháp khử dính trứng bằng tanin 0,6 ppm và ấp trứng trong bình phễu cũng được áp dụng cho một số đợt thí nghiệm. Thể tích dung dịch tanin để khử dính so với thể tích trứng là 1:1 hoặc 2:1. Tỷ lệ thụ tinh của trứng được kiểm tra ở giai đoạn phôi vị khoảng 10 giờ sau khi gieo tinh, tỷ lệ nở được tính bằng phần trăm của số cá bột so với số trứng thụ tinh.

7. Xử lý thống kê

Sử dụng phần mềm SPSS để xử lý thống kê theo phưong pháp phân tích One-way ANOVA cho các chỉ tiêu độ vận động, tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở.

III. Kết quả và thảo luận

1. Một số đặc điểm sinh học của cá tra

Bảng 2. Một số đặc điểm sinh học của cá tra

Chỉ số	Trung bình	Min	Max
Trọng lượng(kg)	2,8 -0,4	2	4
Chiều dài (cm)	66,1 -3,6	59	75
Số ml tinh/cá thể	3,3 -1,2	0,6	5,6
Ðộ pH	7,54 -0,3	7,14	7,73
Mật độ tinh trùng(x 1010tinh trùng/ml)	4,29 -1,64	2,32	6,26

Mẫu tinh nghiên cứu đặc điểm sinh học thu từ 41 cá tra đực nuôi tại trung tâm Cái Bè. Bảng 2 cho thấy lượng tinh dịch thu được trung bình đạt 3,3ml/cá thể, phụ thuộc vào mùa vụ sinh sản và kích thước của cá đực. Ðộ pH trung bình là 7,45, dao động từ 7,14- 7,73. Mật độ tinh trùng của cá tra là 4,29 x 1010 tinh trùng/ml, dao động từ 2,32- 6,26 x 1010 tinh trùng/ml.

2. Ðộ vận động của tinh trùng

Ðộ vận động của tinh trùng được đánh giá ở các thời điểm bảo quản khác nhau không sai khác có ý nghĩa ở dung dịch Hanks, nhưng sai khác có ý nghĩa thống kê ở dung dịch Hanks không canxi. Tuy nhiên, kết quả đánh giá độ vận động của tinh trùng phụ thuộc nhiều vào khả năng quan sát và kinh nghiệm của người làm thí nghiệm.

3. Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở

Ðể hoàn thiện quy trình bảo quản tinh cá tra dài hạn trong nitơ lỏng, đề tài đã chuẩn xác các bước của quá trình làm đông và kỹ thuật thụ tinh, ấp trứng trong năm 2002 và 2003. Kết quả thụ tinh được trình bày trong bảng 3.

Bảng 3. Kết quả thụ tinh của tinh cá tra bảo quản năm 2002 và 2003

Thời gian bảo quản(ngày)	Dung dịch Hanks không canxi		Dung dịch Hanks		Ðối chứng (ÐC)
	Tỷ lệ thụ tinh (%)	%/ ÐC	Tỷ lệ thụ tinh (%)	%/ ÐC	Tỷ lệ thụ tinh (%)
Năm2002
7	66 5	82,5	54 3	67,5	80 9
21	66 5	84,6	51 2	65,4	78 8
30	19 5	23,2	20 6	24,4	82 8
60	29 19	34,9	16 6	19,3	83 9
Năm 2003
30	33,8 13,2	50,0	41,1 12,8	55,8	73,6 6,2
60	40,6 13,3	60,7	39,6 10,9	59,3	66,8 10
90	37,6 6,1	40,0	36,3 6,2	38,6	94,1 5,4

Sau thời gian bảo quản 7 – 21 ngày tỷ lệ thụ tinh của tinh bảo quản đạt 66% khi dùng dung dịch Hanks không canxi và 51-54 khi dùng dung dịch Hanks. Tỷ lệ thụ tinh của tinh bảo quản giảm rõ rệt khi thời gian bảo quản tăng lên 30-60 ngày, chỉ đạt 19-29% đối với dung dịch Hanks không canxi và 16-20% khi dùng dung dịch Hanks ở thí nghiệm năm 2002. Ðề tài đã nâng cao tỷ lệ thụ tinh của thí nghiệm năm 2003, đạt 36,3-41,1% cho tinh bảo quản từ 1-3 tháng. Tuy nhiên tỷ lệ này vẫn chênh lệch lớn so với tỷ lệ thụ tinh của tinh tươi, chỉ đạt từ 38,6-60,7%. Phân tích thống kê cho kết quả không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) giữa tỷ lệ thụ tinh của tinh bảo quản sử dụng hai dung dịch Hanks và Hanks không canxi, cả hai dung dịch đều kết hợp với 10% DMSO.

Bảng 4. Kết quả nở của tinh cá tra bảo quản năm 2002 và 2003

Thời gian bảo quản (ngày)	Dung dịch Hanks không canxi		Dung dịch Hanks		Ðối chứng (ÐC)
	Tỷ lệ nở (%)	Tỷ lệ nở/ÐC (%)	Tỷ lệ nở (%)	Tỷ lệ nở/ÐC (%)	Tỷ lệ nở (%)
Năm 2002
7	83 2	97,6	80 1	94,1	85 4
21	83 2	102,5	75 4	92,6	81 3
30	72 7	88,9	73 5	90,1	81 5
60	82 8	95,35	75 11	87,2	86 6
Năm 2003
30	45,6 10,9	70,9	45,8 11,1	71,3	64,2 9,8
60	59,8 13,9	67,4	63,5 11	71,6	88,7 5,1
90	61,8 9,1	73,1	61,8 7,1	73,1	84,5 5,3

Bảng 4 cho thấy tỷ lệ nở của trứng thụ tinh bằng tinh bảo quản khá cao và ổn định trong các đợt thí nghiệm của năm 2002. Ðối với tinh bảo quản sử dụng dung dịch Hanks không canxi, tỷ lệ nở dao động từ 72-83%, thậm chí tinh bảo quản 21 ngày cho tỷ lệ nở cao hơn cả lô đối chứng (102% so với đối chứng). Kết quả này không sai khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) so với đối chứng. Tỷ lệ nở dao động từ 73-80% cho tinh bảo quản sử dụng dung dịch Hanks. Thời gian bảo quản thí nghiệm của năm 2003 kéo dài 3 tháng, tỷ lệ nở của tinh bảo quản ở từng thời điểm khác nhau dao động lớn. Tỷ lệ nở của tinh bảo quản 1 tháng đạt khoảng 46% thấp hơn cả tinh bảo quản 3 tháng cho tỷ lệ nở 61,8%. Tuy nhiên, việc đánh giá chất lượng tinh bảo quản còn phụ thuộc nhiều vào chất lượng trứng của mỗi đợt thí nghiệm. So sánh dựa trên chỉ tiêu tỷ lệ nở so với đối chứng thì không có sự chênh lệch giữa tinh bảo quản từ 1- 3 tháng, dao động từ 67,4-73,1% cho tinh trùng bảo quản bằng dung dịch Hanks không canxi và 71,3-73,1% cho dung dịch Hanks.

Cá tra là đối tượng cá nước ngọt chưa được nghiên cứu bảo quản tinh rộng rãi. Kết quả nghiên cứu này đã đi xa hơn một bước so với các nghiên cứu của Thái Lan (Whitler, 1982) trên cá tra yêu (P.sutchi) và của Canada (Mongkopuuya và ctv, 2000) trên cá tra dầu (P.gigas) là đạt tỷ lệ nở tương đối cao và ổn định so với đối chứng. Tỷ lệ nở có thể được xem là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hiệu quả khi áp dụng vào thực tiễn sản xuất.

IV. Kết luận

Ðề tài đã thành công trong công nghệ bảo quản tinh cá tra dài hạn bằng nitơ lỏng có ý nghĩa quan trọng trong công tác lưu giữ nguồn gen và thực tiễn sản xuất. Dung dịch Hanks không canxi và dung dịch Hanks là những dung dịch bảo quản thích hợp cho quy trình bảo quản tinh cá tra. Thời gian bảo quản kéo dài có thể làm giảm sức sống của tinh bảo quản. Tỷ lệ thụ tinh của tinh bảo quản 7 ngày và 3 tháng lần lượt là 54-66% (67,5-82,5% đối chứng) và 36,3-37,6% (38,6-40% đối chứng).Tỷ lệ nở đạt 80-83% (94,1-97,6% đối chứng) cho tinh bảo quản 7 ngày và 61,8% (73,1% đối chứng) cho tinh bảo quản 3 tháng. Nếu máy đông tinh đạt tốc độ hạ nhiệt cao và ổn định có thể nâng cao chất lượng tinh bảo quản hơn nữa.